基因芯片技术分析骨髓间充质干细胞神经分化中Wnt信号通路的激活

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.10.003

摘要/Abstract

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文题释义：

Wnt信号通路：是细胞个体传递信息、细胞生长发育、凋亡的信号通路，对胚胎和体轴发育特别是神经系统的发育起到重要作用。该信号通路可分为4支，其中最经典的研究的比较清楚的是Wnt/β-catenin信号通路，这是一条在生物进化中极为保守的通路。

基因芯片技术：同时将大量的探针分子固定到固相支持物上，借助核酸分子杂交配对的特性对DNA样品的序列信息进行高效的解读和分析。该技术在疾病易感基因发现、疾病分子水平诊断、基因功能确认、多靶位同步超高通量药物筛选以及病原体检测等医学与生物学领域得到广泛应用。其原理是采用光导原位合成或显微印刷等方法将大量特定序列的探针分子密集、有序地固定于经过相应处理的硅片、玻片、硝酸纤维素膜等载体上，然后加入标记的待测样品，进行多元杂交，通过杂交信号的强弱及分布分析目的分子的有无、数量及序列，从而获得受检样品的遗传信息。

背景：通过对骨髓间充质干细胞诱导向神经元样分化的Wnt信号调控机制进行研究，为骨髓间充质干细胞在脊髓损伤及组织工程中的应用打下基础。

目的：应用基因芯片技术测试人骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化过程中相关基因的表达变化。

方法：分离和纯化人骨髓间充质干细胞，选取第5代细胞，基于Gateway^TM载体构建技术构建慢病毒载体，将Wnt-1转导至人骨髓间充质干细胞。设置3个实验组，分别为对照组、未转导组以及转导组，诱导人骨髓间充质干细胞神经分化，扫描电镜下观察细胞形态，应用基因芯片检测Wnt信号通路基因的调控变化及差异表达。

结果与结论：①扫描电镜下发现：转导Wnt-1并诱导分化的细胞具有神经元样细胞的形态。②基因芯片杂交技术检测发现：3 287个基因上调，4 215个基因下调，与神经系统发育和分化相关基因有上调和下调的变化。③从中挑选了相关基因验证，表明转导Wnt-1后细胞内Wnt通路激活，下游基因转录，促进人骨髓间充质干细胞的神经分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0003-3235-050X (林治平)

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 骨髓间充质干细胞, 转导, 神经分化, 电镜, Wnt信号通路, 基因芯片

Abstract:

BACKGROUND: It will provide a new insight into the future application of bone marrow mesenchymal stem cells in the treatment of spinal cord injury and tissue engineering by studying the effect of activation of Wnt signaling pathway in the neuronal differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells.
OBJECTIVE: To detect the expression of related genes by gene chip technology during the neuronal differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells.
METHODS: Human bone marrow mesenchymal stem cells were isolated and purified, and passage 5 cells were obtained. GatewayTM technology was used to build lentiviral vectors that was used to transfect Wnt-1 into human bone marrow mesenchymal stem cells. Control, non-transduction and transduction groups were set in this study. Human bone marrow mesenchymal stem cells were then induced to differentiate into neurons. Cell morphology was observed under inverted phase contrast microscope. Gene chip was used to detect the regulation changes and the differential expression of related genes in the Wnt signaling pathway.
RESULTS AND CONCLUSION: Under the scanning electron microscope, the transfected cells were found to have the similar morphology of neuron-like cells. Analysis by the gene chip hybridization technique showed that 3 287 genes were up-regulated and 4 215 genes were down-regulated in the signal pathway. In the Wnt signaling pathway, genes related to the nervous system development and differentiation were up- or down-regulated. It is verified that the Wnt signal pathway is activated via Wnt-1 transduction, and the downstream genes appear to have genetic transcription so as to promote the neuronal differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

林治平，曾荣，林颢. 基因芯片技术分析骨髓间充质干细胞神经分化中Wnt信号通路的激活[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(10): 1389-1395.

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图/表（结果） 3

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引言

骨髓间充质干细胞可自我复制、增殖、有多向分化潜能，属多能干细胞^[1-8]。在体内外培养条件下，骨髓间充质干细胞可向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞等间充质细胞分化^[9]，还可以分化为神经胶质细胞和神经元细胞^[10-13]。骨髓间充质干细胞自身具有易于被基因转染且稳定表达，能够扩增并可自体移植等特点，已被广泛用于细胞治疗及靶向治疗。调控人骨髓间充质干细胞分化是一个十分复杂的过程，并且受多因素的综合影响，对Wnt信号通路的研究发现，其活跃的靶基因在骨髓间充质干细胞分化过程中均有表达，并证实该信号通路在促进人骨髓间充质干细胞增殖和分化等生物学功能中起着重要作用。

2002年，Tang等^[14]报道Wnt-1基因转染P19细胞后，可以不经视黄酸诱导自发向神经元样细胞分化，免疫组化结果显示NF、MAP2阳性表达，GFAP阴性表达，RT-PCR显示分化后细胞的bHLH，Mash-1和Ngn-l基因均上调，结果表明Wnt-1基因能促进P19细胞神经分化。研究认为Wnt在细胞内的通路至少有4条，其中比较清楚的是经典Wnt信号通路，在细胞诱导、增殖和分化起到重要的作用^[15-19]。实验选取Wnt-1基因的经典通路，探讨基因转导后人骨髓间充质干细胞神经分化调控机制，进而深入了解人骨髓间充质干细胞的分化潜质。

基因芯片又称DNA芯片(DNA chip)或DNA微阵列(DNA microarray)，其通过杂交信号的强弱及分布来分析目的分子的有无、数量及序列，从而获得受检样品的遗传信息，能够同时平行分析数万个基因，进行高通量筛选与检测分析，适用于分析基因组的序列信息，分析出基因的调控变化及表达差异^[20]。实验采用基因芯片技术对转导Wnt-1并诱导其向神经方向分化后的成熟细胞进行基因检测，对比转导前后Wnt信号通路基因的差异变化，来证明Wnt信号通路的基因激活，为将来进一步分析神经分化的机制提供实验理论基础。

材料方法

1.1 设计体外对比观察实验。

1.2 时间及地点实验于2013年2月至2015年1月在广东医学院及广东医学院附属医院科研中心实验室、广州赛业公司、上海康成公司完成。

1.3 材料

1.3.1 骨髓取材于股骨骨折或者股骨颈骨折成年患者，并征得患者和家属同意。纳入标准：年龄在15-45岁的股骨骨折或者股骨颈骨折成年患者。排除标准：患有器质性疾病的患者。

1.3.2 主要试剂成人骨髓间质干细胞完全培养基、神经诱导分化培养液：L-DMEM +200 μmol/L脂溶性抗氧化剂BHA、1% Triton X-100、无血清Opti-MEM^®I培养液、1×PBS、0.25%Trypsin-0.04%EDTA、pLV.Des3d.P/ puro慢病毒表达载体、293FT细胞(广州Cyagen公司)；Stbl3感受态菌、Trizol(美国Invitrogen公司)；pCR- BluntII-TOPO-WNT3A(cDNA克隆载体)、pCR-BluntII- TOPO-WNT3A质粒(长沙赢润)；低糖-DMEM、高糖- DMEM(美国Gibico公司)；胎牛血清(美国Hyclone公司)；Ficoll-Paque分离液(1.077×10³g/L)(美国Pharmacia公司)；RIPA裂解液(强)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天)；RNA酶抑制剂(上海康成)；2.5 mmol/L dNTP混合液、Taq聚合酶、100 bp DNA Ladder(天根生化科技公司)；引物设计软件：Primer 5.0、基因芯片(上海康成)；三氯甲烷、无水乙醇、异丙醇等其他试剂(广州化学试剂厂)。

1.3.3 主要仪器 SW-CJ-2FD洁净工作台(苏州安泰)；IX51研究级倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)；5418离心机、可调式移液器、核酸蛋白测定仪(德国Eppendorf公司)；J-30I高速离心机(美国Beckman公司)；NU4750E二氧化碳孵箱(美国Nuaire公司)；M-26 UV transilluminator(美国UVP公司)；MW721AAU-PW微波炉(中国美的)；风热式电热恒温干燥箱(广州东方电热干燥设备厂)；培养板，培养瓶，培养皿(美国Corning公司)；KS130水平摇床、RH-KTC磁力搅拌器(德国IKA公司)；VE180微型垂直电泳槽(上海Tanon公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 人骨髓间充质干细胞分离培养及传代^[21] 抽取股骨骨髓10 mL，置于肝素抗凝管(300 U/mL)中摇匀，用L-DMEM培养液10 mL分2支离心管稀释，550×g离心8 min，弃上清及脂肪层。然后以6 mL L-DMEM稀释，混匀。取Ficoll-Hypaque液(密度为1.077×10³g/L)3 mL放入离心管中，255×g室温离心30 min，离心后内容物分3层，上层为血浆，中间层为分层液，底层为红细胞和多核细胞。在上、中层液体界面之间的为乳白色浑浊的单核细胞层，呈白膜状。用毛细吸管轻轻插到该层，吸取单核细胞，移入另一离心管中。加入5倍以上体积的D-Hank’s液，打散，550×g离心20 min，弃上清，重复洗涤2次。用成人骨髓间质干细胞完全培养基重悬细胞，取20 μL行细胞计数，以1×10⁹ L^-1细胞浓度接种于6孔板，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂、95%湿度孵箱常规培养。72 h后更换新鲜培养液，去除未贴壁细胞，以后每隔3 d更换1次培养液，细胞标记为第1代。细胞传代15-20 d后，待贴壁细胞融合达80%-90%，弃培养液，1×PBS清洗3次，以去除残留的血清。吸去PBS，加入适量Trypsin-EDTA，使Trypsin-EDTA均匀覆盖培养器皿表面，消化一两分钟，显微镜下可见细胞间隙增大，细胞变圆，用手轻拍培养器皿的壁，立即加入2 mL成人骨髓间质干细胞完全培养基终止消化。用吸管吸取液体，轻轻吹打培养器皿表面，反复3-5次，使细胞彻底脱离瓶皿底壁，将细胞移入离心管中，再向培养瓶中加入1×PBS洗一两次，并将洗液一并转移至离心管中，以244×g速度离心4 min，加入5 mL成人骨髓间质干细胞完全培养基重悬细胞沉淀，用吸管轻轻吹打收集的细胞悬液。

1.4.2 通过慢病毒转导Wnt-1到人骨髓间充质干细胞^[21] 通过Cyagen公司在线设计软件vectorbuilder (www.vectorbuilder.org)设计载体序列选择慢病毒表达载体(Lentiviral Expression Vector)，广泛表达启动子EF1A，在目的基因Wnt-3a(human)及示踪基因eGFP中插入连接基因Internal Ribosome Entry Site(IRES)，同时选择药物抗性筛选基因Puromycin。构建表达克隆pLV.EX3d.P/puro-EF1A> Wnt-1> IRES/eGFP，利用慢病毒载体4质粒系统共转染293T细胞，包装慢病毒载体，G418筛选并测定滴度。转染骨髓间充质干细胞，使之稳定表达Wnt蛋白并维持培养。

1.4.3 hBMSCs-Wnt-1诱导分化为神经元细胞设置转导组、未转导组及对照组。转导组为扩增后的hBMSCs-Wnt-1，未转导组取生长良好的第3代人骨髓间充质干细胞，对照组取同时期hBMSCs-Wnt-1，待细胞均达到80%-90%融合时，分别对各组细胞消化计数。以5×10³/cm²细胞密度将消化好的细胞接种于事先包被多聚赖氨酸/层粘连蛋白细胞培养板中，加入适量神经诱导分化预培养液进行预培养。次日，洗去预培养液，换成神经诱导分化预诱导液，进行预诱导24 h。预诱导24 h后，吸去预诱导液，PBS洗2遍后，加入神经诱导分化诱导液开始正式诱导，时间为24 h。对照组始终使用预培养液。观察各组细胞在不同时点的形态变化，选择最佳正式诱导时间进行诱导分化。

1.4.4 扫描电镜观察提前对需要接种细胞爬片(放置于24孔板内)进行多聚赖氨酸/层粘连蛋白包被；待细胞达到80%-90%融合时，分别对各组细胞消化计数。以5×10³/cm²细胞密度将消化好的细胞接种于事先包被好的细胞爬片中，加适量神经诱导分化预培养液进行预培养。第2天洗去预培养液，换成神经诱导分化预诱导液，进行预诱导24 h。预诱导24 h后，吸去预诱导液，PBS洗2遍后，加入神经诱导分化诱导液开始正式诱导。分别在诱导前，诱导3，6，24 h对实验细胞进行扫描电镜制样前处理。取不同时间段细胞，吸去细胞培养液，尽量吸干；用0.01 mol/L PBS洗2次，每次5 min；加入3%戊二醛4 ℃固定5 h，如未能马上进行下一步制备，则放入4 ℃保存备用，可保存1周；0.01 mol/L PBS洗6次，每次20 min，体积分数为30%乙醇2次，每次10 min；体积分数为50%乙醇2次，每次10 min；体积分数为70%乙醇1次，每次15 min，过夜；体积分数为90%乙醇1次，每次10-15 min；体积分数为95%乙醇1次，每次10- 15 min；无水丙酮或无水乙醇(加无水CaCl₂)3次，每次10-15 min；叔丁醇2次，每次10-15 min；冷冻干燥。样品导电处理：经喷镀均匀后，完成镜下观察。

1.4.5 基因芯片检测取对照组、未转导组及转导组3个样本，用NanoDrop ND-1000 测定RNA的数量和质量。标准的变性琼脂糖凝胶电泳评估RNA的完整性，人类12×135K基因表达阵列由Roche NimbleGen制作，同时在每片杂交12个样品。从NCBI等权威数据库收集大约45 033个基因数据。双链基因(双链cDNA)的合成是用Invitrogen SuperScript公司的DS-cDNA合成试剂盒，在100 pmol寡dt的标引存在下由5 μg总RNA合成。由Invitrogen公司的DS-cDNA合成试剂盒来反转录；用NimbleGen的单彩色的DNA标记试剂盒标记双链DNA；用NimbleGen杂交系统来行阵列杂交，杂交后用NimbleGen进行洗涤缓冲液试剂盒进行洗涤。在无臭氧环境中洗净后，用Axon GenePix 4000B扫描仪对芯片进行扫描。用5 μm/象素Axon GenePix 4000B扫描仪对芯片进行点阵扫描。用标准的富集计算方法进行GO分析与路径分析。

1.5 主要观察指标 ①转导前后骨髓间充质干细胞形态。②基因芯片检测结果。

讨论

人骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化，不单止在形态学方面应该具有与神经元样细胞相同或者相似的形态特征，还要在功能学方面满足组织工程学的应用需求。因此，在人骨髓间充质干细胞的分离培养、细胞传代、慢病毒转导的前期实验研究发现，人骨髓间充质干细胞诱导分化后已经具有与神经元样细胞相似的形态学功能^[21]，但其分化过程中的机制研究尚在探讨。通过对Wnt信号转导通路分析，促进对人骨髓间充质干细胞神经分化调控机制的了解，优化神经诱导方法，使人骨髓间充质干细胞将来能成为组织工程应用于临床治疗的种子细胞，这将推动人骨髓间充质干细胞在细胞靶向治疗中的应用走上一个新台阶，为临床治疗脊髓及神经损伤疾病提供更好的支持与帮助。

Wnt信号通路是细胞个体传递信息、细胞生长发育、凋亡的信号通路，它对胚胎和体轴发育，特别是神经系统的发育起到重要的作用^[22-25]，该信号通路可分为4支，其中最经典的研究的比较清楚的是Wnt/β-catenin信号通路，这是一条在生物进化中极为保守的通路^[26-30]。目前，对人骨髓间充质干细胞中Wnt信号通路的研究逐渐成为热点，但是在基因调控机制上的研究还不够透彻。近年来对Wnt信号通路的研究发现，其各组分在人骨髓间充质干细胞中均有表达，只是不同基因在调控过程中有上调和下调的变化，这些关键基因的变化，提示在骨髓间充质干细胞的增殖和分化过程中具有不同的生物学功能作用^[31-32]。

从分子生物学及基因层面分析，诱导分化后的人骨髓间充质干细胞基因表达谱出现相关调控基因的差异表达，是Wnt信号通路激活的根据，是调控细胞分化的基础。实验应用基因芯片技术来检测与Wnt信号通路相关的基因表达和变化情况，目的在于找到通路当中的关键调节点。骨髓间充质干细胞转导Wnt-1并向神经元样细胞诱导分化，通过差异基因表达谱分析，找到3 287个基因上调，4 215个基因下调。在Wnt信号通路的89个基因当中，与神经系统发育和分化的相关基因都有不同的变化，其中有13个基因上调，6个基因下调。上调的基因有：TCF7，TCF7L1，SLC9A3R1，CCND1，CCND2，APC7，WNT2B，WNT4，WNT5B，WNT13，FOSL1；下调的基因有PPP2CA，EP300，CSNK1A1，FZD1，DIXDC1，FZD7。其中，关键调节位点基因为TCF7L1、SLC9A3R1、CCND2、APC7。通过查询基因表达谱得知，TCF7L1在Wnt信号通路当中起到调控转化生长因子的作用。SLC9A3R1基因编码是钠/氢交换调节的辅助因子，这种蛋白质的相互作用和调节，包括囊性纤维化跨膜电导调节和G-蛋白的调节，如调节β2-肾上腺素受体及甲状旁腺激素1受体偶联受体等各种蛋白质，调控下游蛋白质生成。CCND2基因编码的蛋白属于细胞周期蛋白家族中高度保守的蛋白，这种蛋白质已被证实与肿瘤抑制蛋白Rb蛋白磷酸化有关。APC7是Fos基因家族的4名组成成员之一，其编码的蛋白质亮氨酸拉链可以与AP-1家族蛋白聚集，从而形成复杂的转录因子AP-1，其为细胞增殖、分化、转化起到监管作用。通过RT-PCR验证芯片结果，表明Wnt信号通路激活，调控下游的基因转录，促进神经分化。这些调控主要位点基因在人骨髓间充质干细胞神经分化过程中起到关键的调节作用。

实验将人骨髓间充质干细胞转导Wnt-1基因并诱导向神经元细胞分化，发现其在形态学上与神经细胞有着极大的相似性，并且应用基因芯片技术检测了实验分组的差异基因表达谱，从分子生物学层面去了解Wnt信号通路在人骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化过程中的基因调控作用的分子生物学概貌，从宏观方面分析了经典信号通路的调控机制与位点，以及相关基因的相互作用。通过对通路当中的少数几个基因的相互作用关系的探讨，来推测需诱导上调或者下调的基因，为以后的调控机制研究打下基础，同时也为人骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化应用于临床提供理论依据。

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延伸阅读

BMSCs最早由Friedenstein等发现，是一种能贴附于塑料培养板表面的成纤维样细胞，由于其具有可分化为间充质组织细胞的能力，故称之为间充质干细胞。BMSCs不仅具有取材方便、扩增迅速、无免疫原性、可自体移植等特点，还可以在特定条件下分化为多胚层细胞，故其在细胞治疗等方面具有广阔的应用前景。30多年来，国内外许多实验室致力于研究这种细胞的多向分化潜能。近年来，BMSCs诱导分化成神经元样细胞成为研究的热点。目前，国内外许多学者在进行BMSCs治疗脊髓损伤方面研究，并取得了阶段性成果，同时仍有许多问题亟需解决。

现已证实：人体各组织中均有着干细胞的存在，它们受体内多种基因的调控可以分化为各种终末细胞，但干细胞本身可以通过增殖来保持一定的数量。BMSCs作为骨髓来源的干细胞，其最为显著的两个特征就是体外高度增殖和跨系统多向分化潜能即可塑性。近年来，随着对BMSCs增殖分子机制研究的深入，人们开始对Wnt这一古老的信号通路在BMSCs的增殖和神经分化过程中所起到的作用产生了浓厚的兴趣。Baksh D等联合应用Wnt3a及Wnt5a培养BMSCs时发现，在Wnt3a的协同作用下，LRP5和TCF1通过经典Wnt信号通路促进BMSCs的增殖。Wnt5a则通过非经典通路拮抗Wnt3a的作用，阻断Wnt3a对增殖的促进作用。有资料显示，虽然在单独使用Wnt3a的情况下，有利于BMSCs维持干性特征，但是在诱导剂共培养的情况下，却可以促使其分化。

Wnt信号通路是一个家族信号，除了Wnt3a,wnt5a,还有wnt1,wnt2,wnt2a等等信号，这些信号通路在BMSCs向神经元样细胞分化过程当中的作用及机制，目前还没有完全掌握，这个有待于更进一步的深入研究分析。